三七鉴别方法有哪些（三七有效成分快速鉴别的方法）

三七鉴别方法有哪些（三七有效成分快速鉴别的方法）

一种基于nmr波谱法对三七有效成分快速鉴别的方法

技术领域

1.本发明涉及一种基于nmr波谱法对三七有效成分快速鉴别的方法，属于分析检测技术领域。

背景技术：

2.三七(panax notoginseng)，为五加科人参属植物，是中国传统名贵中药材。因其具有散瘀止血、消肿定痛、抗炎和抗氧化等功效，因此，在药品、化妆品、保健品等领域有广泛应用。三七主要功效成分为三七总皂苷(total panax notoginseng saponins,tpns)，含量占全株植物7％左右，绝大多数tpns的化学结构属达玛烷型四环三萜皂苷。三七根的主要单体皂苷包括人参皂苷rg1、rb1、rd和三七皂苷r1，含量约占tpns的80％。

3.植物原材和提取物的质量直接关系到制成品功效。目前市售三七根提取液产品的鉴别与定量多采用tlc、hplc、gc等方法。尽管色谱类方法具有检测灵敏度高等优点，然而实际应用中，由于植物源样品成分复杂，色谱峰分离度低，往往需要繁复的样品预处理步骤，分析过程耗时长费用高。同时，此类天然产物的标准对照品多数不易获得，价格昂贵，也限制了方法的广泛应用。另外，由于实际样品中成分的复杂性，植物源样品鉴别也经常采用指纹图谱对检材整体评价，这种非靶向分析方法不能给出确切的成分信息。质谱(ms)能阐释物质的化学结构，液质联用(hplc-ms)技术为植物源产品鉴别与定量分析提供了有力支持。然而在快速鉴别领域，由于这类检测的样品制备程序繁琐，数据解读复杂而不具优势，如被检测成分定性也需要有相应标准品；色谱柱固定相对样品溶液相ph、温度有适用范围要求等。以上对hplc应用于复杂被测对象—植物源样品分析—带来一定困难。

4.核磁共振波谱技术具有重现性好、非破坏性、非特异性和可定量等优点，在植物初级代谢物或特异代谢物(如酚类、生物碱、萜类、聚酮化合物、生氰糖苷、芥子油苷、香豆素、鞣质、苯并恶唑类等)的研究中已获得非常广泛的应用，液体nmr已是表征植物样品提取物中极性、半极性或非极性化合物结构的通用工具。但是植物源样品1h nmr存在谱峰重叠严重、谱图复杂的特点，故很难直接用于实际样品的鉴定。为了克服这类问题，人们提出了许多新型的核磁检测技术。例如姜阳明等采用cpmg脉冲序列采集杜仲的特征化合物松脂醇二葡萄糖苷的1h nmr谱，对谱图作craft分析提取到杜仲1h nmr谱的特征信号，并用于杜仲产地鉴别。鉴于植物源样品成分的复杂性，也有对标准植物检材采集1d nmr图谱，构建nmr指纹谱库，以非靶向分析建立鉴别模型的技术。nmr非靶向分析一般采用微步径积分法处理图谱，对数据聚类分析进而达到鉴别的目的。非靶向分析具有操作简便易行的特点，在实际工作和三七产品鉴定中具有广泛的应用前景，然而该方法不能明确指证其中有效成分。

5.hsqc-tocsy核磁共振谱是一种hsqc法与tocsy法相结合的一种2d nmr相关实验。在hsqc-tocsy谱图中既显示一键1h-13

c偶合(hsqc)，还显示了整个自旋体系中的相关性(tocsy)。例如藤荣伟等在分析大叶吊兰苷a时，采用hmqc-tocsy法成功归属分子中糖基部分的结构。hmqc与hsqc方法稍有区别，同为观察一键1h-13

c偶合。hsqc-tocsy谱法在复杂糖类和肽类化合物结构分析应用较广泛。鉴于目前尚没有适合于三七产品快速鉴定的理想方

11进行处理。

20.在本发明的一种实施方式中，所述自旋共振信号群通过

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c nmr谱全归属的基础上获得。

21.在本发明的一种实施方式中，所述

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c nmr谱数据采集条件：脉冲序列zgpg30；采样时间(aq)1.36s；时间域(td)64k；扫描次数(ns)4096；弛豫时间(d1)2s，谱宽(sw)24038.4hz。

22.本发明还提供了上述方法在检测领域的应用。

23.有益效果：

24.本发明操作步骤简单，可以对三七植物原材及其制成品快速靶向鉴别。

25.本发明基于三七植物原材有效成分—三七总皂苷(total panax notoginseng saponins,tpns)，其中的主要单体皂苷具有共同母核结构——带侧链烯-24达玛烷环三七鉴别，本方法实现了对三七有效成分快速靶向鉴别，以2dhsqc-tocsy谱图是否显示三七总皂苷特征自旋共振信号群，判断所检测产品是否真实含有三七有效成分，本方法指标值

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c化学位移的检测误差δδ≤0.02(n＝5)。

附图说明

26.图1为所采集hsqc-tocsy谱图。

27.图2为所采集

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cnmr谱图。

28.图3为所采集1hnmr谱图。

具体实施方式

29.下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

30.实施例1参数优化

31.(1)hsqc-tocsy谱数据采集参数自旋锁定(spin lock)时间d9需优化，以保证采集数据性噪比足够高，相关峰系在谱图显现。

32.固定其它谱图采集和数据处理条件(同实施例2)，以d9为单一变量，分别修改d9为20、30、40、50、60、70、80、100、120ms，观察相关峰的峰容积变化，并用其它nmr方法交叉验证相关峰。研究发现，当d9为50～80ms时，能够取得三七皂苷特征自旋共振信号群，即能够同时检出四条峰系，因此，最终确定d9优化参数为50～80ms。

33.(2)当待测样品为三七提取液时，其中固体小柱品牌和规格、甲醇的洗脱体积需优化，以保证尽可能除去助溶剂而目标提取物不致损失。

34.平行将市售三七提取液吸附于固体小柱，单因素观察甲醇洗脱体积的影响。采用甲醇分别洗脱2、4、6、8、10ml，采用气相色谱仪测定助溶剂在洗脱液中含量，紫外可见分光光度计测定三七总皂苷在洗脱液中含量。绘制洗脱曲线，计算助溶剂累计清除率、三七总皂苷总损失量，研究发现，当甲醇洗脱体积为6～8ml时，助溶剂累计清除率为》90％、三七总皂苷总损失量为《5％，满足要求，故优选洗脱体积为6～8ml。

35.(3)当待测样品为三七根时，其中提取液乙醇浓度和大孔吸附树脂柱的类型需优化，以保证目标提取物提取率高而共存杂质被清除。

36.具体参照(2)制定优化方案。平行将市售三七根粉末用不同浓度乙醇溶液浸提，单

因素观察乙醇浓度对三七总皂苷提取率的影响。采用乙醇浓度分别为0、20、40、50、70、90％，紫外可见分光光度计测定三七总皂苷在浸提液中含量。最终乙醇优选浓度60～80％。

37.选用5种不同类型的大孔吸附树脂(x-5，ab-8，nk-2，d3520，d101)进行处理，考察不同树脂对三七总皂苷的保留率。最终确定使用d3520或d101纯化三七根乙醇浸提液，三七总皂苷保留率》80％。

38.实施例2：三七提取液中三七有效成分的快速鉴别

39.(1)样品前处理。固相萃取小柱是依次用甲醇、20％(v/v)甲醇水溶液和超纯水淋洗进行活化，精密吸取适量三七提取液原样，滴加上样到已活化固相萃取小柱，使其中tpns吸附于固相小柱同时分去原液中助溶剂。用7ml甲醇淋洗小柱三次以洗脱tpns。收集全部洗脱液，于55℃水浴挥发甲醇溶剂，再冷冻干燥，获得白色冻干粉末即为三七根提取液的净化富集产物。

40.(2)核磁共振波谱分析。

[0041]1h nmr谱数据采集条件：脉冲序列zg30；采样时间(aq)4.08s；时间域(td)64k；扫描次数(ns)64；弛豫时间(d1)5s；谱宽(sw)6393.9hz。

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c nmr谱数据采集条件：脉冲序列zgpg30；采样时间(aq)1.36s；时间域(td)64k；扫描次数(ns)4096；弛豫时间(d1)2s，谱宽(sw)24038.4hz。

[0042]

dept谱数据采集条件：脉冲序列deptst135；采样时间(aq)2.03s；时间域(td)64k；扫描次数(ns)512；谱宽(sw)16129.0hz。

[0043]

2d nmr谱数据采集谱宽与1d nmr氢谱、碳谱谱宽一致。

[0044]

hmbc谱数据采集脉冲序列hmbcgpndqf；cnst13为8hz。

[0045]

hsqc谱数据采集脉冲序列hsqcedetgpsp.3；cnst2为145hz。

[0046]

hsqc-tocsy谱数据采集脉冲序列hsqcdietgpsis.2；设谱宽(6393.9hz，24038.4hz)，弛豫时间2s，采样时间0.16s，自旋锁定(spin lock)时间d9为60ms。谱图数据采用软件bruker topspin 3.6.2和mestrenova 11进行处理。

[0047]

在

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c nmr谱全归属的基础上，观察hsqc-tocsy谱是否显示有三七皂苷特征自旋共振信号群，即沿谱图纵向的4条相关峰系：峰系1为

13

cδ125.8-δ36.1-δ22.8；峰系2为

13

cδ88.8-δ39.0-δ26.5，或δ78.8-δ39.1-δ27.4；峰系3为

13

cδ70.0-δ49.5-δ30.6，或δ70.0-δ48.9-δ31.5；峰系4为

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cδ56.2-δ34.9-δ18.3，或δ77.8-δ61.2-δ44.7，三七提取液所采集的hsqc-tocsy谱图、

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cnmr谱图、1hnmr谱图分别如图1～3所示，观察到存在以上相关峰系，即可确定样品含有三七有效成分。

[0048]

实施例3：三七根中三七有效成分的快速鉴别

[0049]

样品前处理。三七根经粉碎成粗粉。称取适量，用75％的乙醇超声波提取三七粗粉中有效成分三七鉴别，提取液浓缩后上d101大孔吸附树脂柱，水洗除去杂质三七鉴别三七药材薄层鉴别图谱，再以75％的乙醇洗脱，洗脱液经减压浓缩、真空干燥得净化富集产物。

[0050]

核磁共振波谱分析。方法同上实施例1。

[0051]

在

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c nmr谱全归属的基础上，观察hsqc-tocsy谱是否显示有三七皂苷特征自旋共振信号群，即沿谱图纵向的4条相关峰系。峰系1为

13

cδ125.8-δ36.1-δ22.8；峰系2为

13

cδ88.8-δ39.0-δ26.5，或δ78.8-δ39.1-δ27.4；峰系3为

13

cδ70.0-δ49.5-δ30.6，或δ70.0-δ48.9-δ31.5；峰系4为

13

cδ56.2-δ34.9-δ18.3，或δ77.8-δ61.2-δ44.7，观察到存在以上相关

峰系，即可确定样品含有三七有效成分。

[0052]

实施例4：方法的准确性的验证：

[0053]

首先采用标准对照品制备三七总皂苷混合标准液，其中含有单体皂苷为人参皂苷rg1、rb1、rd和三七皂苷r1。精密称取四种单体皂苷各60mg，溶于1500μl氘代溶剂。完全溶解后均分为三份。一份即时使用，另两份冻存。按与实施例1相同的实验条件与检测参数，在一个月内分三次采集hsqc-tocsy、1h、

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c核磁共振谱实验数据。谱图数据采用软件bruker topspin 3.6.2和mestrenova 11进行处理，对数据做化学位移校准、基线校正、相位调整，1h、

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c谱图数据投影hsqc-tocsy谱图坐标。hsqc-tocsy谱图显示沿谱图纵向的4条相关峰系，记录相应化学位移δ(

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c)并计算三次实验化学位移δ(

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c)平均值及rsd。结果显示指标值

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c化学位移的检测误差δδ≤0.02(n＝5)。

[0054]

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。